Metagenomika wyjaśniona: Jak sekwencjonowanie genów wykrywa ukryte infekcje

Co naprawdę robi sekwencjonowanie metagenomowe

Standardowe testy na infekcje zadają jedno pytanie na raz: czy to wirus grypy, czy to E. coli, czy ta kultura wyhoduje znaną bakterię. Metagenomowe sekwencjonowanie nowej generacji, lub mNGS, działa odwrotnie. Ekstrahuje każdy fragment DNA i RNA obecny w próbce krwi, płynu mózgowordzeniowego lub tkanki i sekwencjonuje wszystko, a następnie porównuje wynik z bazami danych referencyjnymi, aby zidentyfikować wszelkie organizmy, zgodnie z przeglądem tej techniki opublikowanym na platformie PubMed Central NCBI.

Ponieważ test nie wymaga wcześniejszej hipotezy dotyczącej sprawcy, może oznaczyć bakterie, wirusy, grzyby i pasożyty w jednym uruchomieniu, w tym patogeny, które klinician nie rozpatrywał, stwierdza przegląd.

Od odkrycia Covid-19 do anulowanego przeszczepu

Najwyraźniejsza publiczna demonstracja tej techniki miała miejsce w końcu 2019 r., gdy chińscy wirusologowie badający niewyjaśnione przypadki pneumonii w Wuhanie nie potrafili zidentyfikować przyczyny za pomocą konwencjonalnych testów. Przełączenie na sekwencjonowanie metagenomowe pokazało, że materiał genetyczny pasował do rodziny koronawirusów, odkrycie zgłoszone przez BBC Future, które przyspieszyło pracę diagnostyczną i szczepionkową nad tym, co stało się znane jako Covid-19.

Przypadki poszczególnych pacjentów przytaczane przez BBC Future ilustrują postawę. Na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco kobieta z zapaleniem opon mózgowo-rdzeniowych i niewydolnością wątroby była przeznaczona do przeszczepu wątroby, gdy testowanie metagenomowe zidentyfikowało wirus zapalenia wątroby E. «Daliśmy jej lek przeciwwirusowy, wyzdrowniała i uratowaliśmy ją przed przeszczepem», powiedział Charles Chiu, profesor na UCSF cytowany w raporcie. W oddzielnym projekcie pilotażowym w londyńskim szpitalu to samo podejście zidentyfikowało gruźlicę u pacjenta, który miał być przypuszczalnie rakiem płuc, unikając niepotrzebnej operacji, zgodnie z tym samym raportem.

Szybciej, ale jeszcze nie rutynowo

Czas realizacji był główną przeszkodą. Niranjan Nagarajan z Narodowego Uniwersytetu Singapuru powiedział BBC Future, że analiza metagenomowa zajmowała "kilka dni do tygodnia"; maszyny sekwencjonujące mogą teraz generować wyniki DNA w jeden do dwóch godzin, a narzędzia sztucznej inteligencji przyspieszają krok dopasowania wzorów.

Przegląd PubMed Central podaje bardziej szczegółowe dane: konwencjonalne przepływy pracy diagnostyczne zazwyczaj zajmują 24 do 72 godzin, podczas gdy sekwencjonowanie oparte na nanoporach — technologia długiego czytania — dostarczyło wyniki w jeden dzień w 86% przypadków, ze średnim czasem realizacji 6,7 godziny. Koszty sekwencjonowania na próbkę wynoszą około 100 do 300 dolarów w zależności od platformy, stwierdza przegląd, choć ta liczba nie uwzględnia kosztów pracy, obliczeń i przechowywania, które dodają się do rzeczywistego kosztu przeprowadzenia testu.

Gdzie mNGS przewyższa standardowe testy — i gdzie nadal się opóźnia

Ten sam przegląd zestawił wyniki z wielu badań klinicznych porównujących mNGS z diagnostyką konwencjonalną w kilku typach infekcji.

Te zyski wiążą się z zastrzeżeniami technicznymi, które przegląd oznacza jako nierozwiązane. W próbkach krwi lub płynu mózgowordzeniowego ponad 90% sekwencji może pochodzić z własnych komórek pacjenta, a nie z patogenu, maskując słabe sygnały mikrobiologiczne. W próbkach zawierających bardzo mało mikrobów zanieczyszczenie z odczynników laboratoryjnych może stanowić do 45% zgłoszonych sekwencji. Przegląd również odnotowuje, że nie ma uzgodnionego progu liczby sekwencji do wywołania wyniku pozytywnego i że pojedyncza zmiana tego progu może zmienić wynik próbki granicznej z pozytywnego na ujemny.

Status regulacyjny pogłębia niepewność: w Stanach Zjednoczonych większość testów mNGS działa jako testy opracowane w laboratorium certyfikowane w ramach CLIA, a nie testy zatwierdzone przez Food and Drug Administration, nie ma dedykowanego kodu rozliczeniowego ubezpieczenia dla tej procedury, a ponad 23% związanych roszczeń ubezpieczeniowych jest odrzucanych, zgodnie z przeglądem.

Używanie sekwencjonowania do wychwycenia wybuchów w szpitalach

Pokrewnym zastosowaniem jest śledzenie, jak infekcja rozprzestrzenia się w szpitalu, a nie diagnozowanie pojedynczego pacjenta. W Medycznym Centrum Uniwersytetu Nebraska kliniczny mikrobiolog Shawn Freed używa długoczytającego sekwencjonowania całego genomu w połączeniu z uczeniem maszynowym do porównywania próbek bakteryjnych zebranych od pacjentów i zaznaczania potencjalnych wybuchów na wczesnym etapie, zgodnie z komunikatem prasowym UNMC.

Zespół Freeda sekwencjonował 40 izolatów bakterii gram-ujemnych i 15 próbek Enterococcus opornych na wankomycynę od pacjentów Nebraska Medicine hospitalizowanych przez więcej niż dwa dni, a następnie przeprowadził analizę filogenetyczną, aby zobaczyć, jak blisko spokrewnione są szczepy. Raport UNMC zauważa, że zespół wybrał sekwencjonowanie długiego czytania częściowo dlatego, że jest tańsze i lepsze w wykrywaniu plazmidów — mobilnych elementów genetycznych, które często niosą geny oporności na antybiotyki — niż alternatywy z krótkim czytaniem. Wybuchy infekcji związane z opieką zdrowotną kosztują szacunkowo 45 miliardów dolarów rocznie w Stanach Zjednoczonych, stwierdza raport, ze względu na przedłużone pobyty w szpitalu i dodatkowe leczenie antybiotykami.

Wczesne ostrzeżenie poza łóżkiem szpitalnym

Laboratoria Nagarajana w Singapurze już stosują tę samą zasadę sekwencjonowania do próbek ścieków i powietrza w celu poszukiwania pojawiających się wirusów, zanim spowodują uznaną epidemię, zgodnie z raportami BBC Future, przypadek użytku, który naukowcy opisują jako możliwy system wczesnego ostrzegania na wypadek przyszłych epidemii.

Zarówno w diagnostyce, jak i w aplikacjach nadzoru naukowcy przywołani opisują sekwencjonowanie metagenomowe jako narzędzie uzupełniające, a nie całkowitą zamianę istniejącej mikrobiologii, czekając na dalszą standaryzację progów, zatwierdzenie regulacyjne i redukcję kosztów.