Cosa fa effettivamente il sequenziamento metagenico
I test di infezione standard pongono una domanda alla volta: è questo un virus dell'influenza, è questo l'E. coli, questa coltura coltiva un batterio noto. Il sequenziamento metagenico di nuova generazione, o mNGS, funziona al contrario. Estrae ogni frammento di DNA e RNA presente in un campione di sangue, liquido spinale o tessuto e sequenzia tutto, quindi confronta il risultato con database di riferimento per identificare gli organismi presenti, secondo una revisione della tecnica pubblicata sulla piattaforma PubMed Central dell'NCBI.
Poiché il test non richiede un'ipotesi preliminare sull'agente causale, può contrassegnare batteri, virus, funghi e parassiti in una singola corsa, inclusi patogeni che un clinico non aveva considerato, secondo la revisione.
Dalla scoperta del Covid-19 a un trapianto cancellato
La dimostrazione pubblica più chiara della tecnica è avvenuta alla fine del 2019, quando i virologi cinesi che indagavano su casi di polmonite inesplicata a Wuhan non potevano identificare una causa con test convenzionali. Il passaggio al sequenziamento metagenico ha mostrato che il materiale genetico corrispondeva alla famiglia dei coronavirus, un risultato riferito da BBC Future che ha accelerato il lavoro diagnostico e vaccinale su quello che divenne noto come Covid-19.
I singoli casi di pazienti citati da BBC Future illustrano l'importanza della questione. All'Università della California, San Francisco, una donna con meningite e insufficienza epatica era prevista per un trapianto di fegato quando il test metagenico ha identificato il virus dell'epatite E invece. "Le abbiamo dato un farmaco antivirale, è migliorata, e le abbiamo risparmiato di sottoporsi al trapianto", ha detto Charles Chiu, professore all'UCSF citato nel rapporto. In uno studio pilota separato presso un ospedale di Londra, lo stesso approccio ha identificato la tubercolosi in un paziente che si presumeva avesse il cancro ai polmoni, evitando un intervento chirurgico non necessario, secondo lo stesso rapporto.
Più veloce, ma non ancora routine
Il tempo di turnaround è stato un importante ostacolo. Niranjan Nagarajan della National University di Singapore ha detto a BBC Future che l'analisi metagenica impiegava "diversi giorni fino a una settimana"; le macchine di sequenziamento possono ora produrre risultati del DNA in una o due ore, con strumenti di intelligenza artificiale che accelerano il passaggio dell'abbinamento di pattern.
La revisione di PubMed Central fornisce cifre più granulari: i flussi di lavoro diagnostici convenzionali richiedono in genere 24-72 ore, mentre il sequenziamento basato su nanopori – una tecnologia di lettura lunga – ha fornito risultati lo stesso giorno nell'86% dei casi, con un tempo di turnaround mediano di 6,7 ore. I costi di sequenziamento per campione vanno da circa 100 a 300 dollari a seconda della piattaforma, secondo la revisione, anche se questa cifra esclude i costi di manodopera, calcolo e archiviazione che si aggiungono al prezzo reale dell'esecuzione del test.
Dove supera i test standard – e dove ancora fatica
La stessa revisione ha compilato risultati da molteplici studi clinici che confrontano mNGS con la diagnostica convenzionale su diversi tipi di infezione.
mNGS rispetto ai test convenzionali in ambienti clinici selezionati| Impostazione clinica | Tasso di rilevamento mNGS | Risultato del metodo tradizionale |
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| Infezioni del sistema nervoso centrale | Rendimento diagnostico del 63% | Meno del 30% con approcci convenzionali |
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| Sepsi / pazienti in ICU | Rilevamento dell'87,7% | 52,3% con emocolture |
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| Febbre di origine sconosciuta | Sensibilità dell'81,5% | 47,3% con coltura |
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| Infezioni del flusso ematico | Rilevamento del 77,7% | 47,9% con coltura |
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| Infezioni articolari periprotesiche | Sensibilità dell'89–95,5% | 72,7% con coltura |
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| Campioni respiratori | Identificazione di patogeni al 95% | 59% con coltura |
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Questi guadagni comportano caveat tecnici che la revisione contrassegna come irrisolti. In campioni di sangue o liquido spinale, oltre il 90% delle letture di sequenziamento possono provenire dalle stesse cellule del paziente piuttosto che da un patogeno, mascherando deboli segnali microbici. In campioni con pochissimi microbi da parte iniziale, la contaminazione dai reagenti di laboratorio può rappresentare fino al 45% delle letture segnalate. La revisione nota anche che non esiste una soglia di conteggio delle letture concordata per definire un risultato positivo, e che una singola modifica a quella soglia può capovolgere un campione limite da positivo a negativo.
Lo stato normativo aggrava l'incertezza: negli Stati Uniti, la maggior parte dei test mNGS viene eseguita come test sviluppati in laboratorio certificati secondo CLIA piuttosto che test approvati dalla Food and Drug Administration, non esiste un codice di fatturazione dell'assicurazione dedicato per la procedura, e più del 23% dei reclami assicurativi correlati viene negato, secondo la revisione.
Utilizzo del sequenziamento per catturare i focolai all'interno degli ospedali
Un'applicazione correlata è il tracciamento di come un'infezione si diffonde una volta dentro un ospedale, piuttosto che diagnosticare un singolo paziente. All'Università medica del Nebraska, il collega di microbiologia clinica Shawn Freed sta utilizzando il sequenziamento del genoma intero a lettura lunga combinato con l'apprendimento automatico per confrontare i campioni batterici raccolti dai pazienti e segnalare i potenziali focolai in anticipo, secondo un rapporto della sala stampa UNMC.
Il team di Freed ha sequenziato 40 isolati batterici Gram-negativi e 15 campioni di Enterococcus resistente alla vancomicina da pazienti ricoverati presso Nebraska Medicine ospedalizzati per più di due giorni, quindi ha eseguito un'analisi filogenetica per vedere come i ceppi sono strettamente correlati. Il rapporto UNMC nota che il team ha scelto il sequenziamento a lettura lunga in parte perché è più economico e migliore nel rilevare i plasmidi – gli elementi genetici mobili che spesso portano i geni di resistenza agli antibiotici – rispetto alle alternative a lettura breve. Le infezioni associate all'assistenza sanitaria costano circa 45 miliardi di dollari all'anno negli Stati Uniti, come afferma il rapporto, attraverso i soggiorni ospedalieri prolungati e il trattamento antibiotico aggiuntivo.
Avviso precoce oltre il letto ospedaliero
I laboratori di Nagarajan a Singapore stanno già applicando lo stesso principio di sequenziamento ai campioni di acque reflue e aria per cercare virus emergenti prima che causino focolai riconosciuti, secondo i rapporti di BBC Future, un caso d'uso che i ricercatori descrivono come un possibile sistema di allerta precoce per le future epidemie.
Su entrambi gli usi diagnostici e di sorveglianza, i ricercatori intervistati descrivono il sequenziamento metagenico come uno strumento complementare piuttosto che una sostituzione all'ingrosso della microbiologia esistente, in sospeso di un'ulteriore standardizzazione delle soglie, dell'autorizzazione normativa e della riduzione dei costi.
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